III . Приготовление препаратов (объектов) для прижизненного изучения клеток и тканей
Объектами прижизненного изучения могут служить тонкие тканевые пленки (брыжейка, плавательная перепонка лягушки), клетки крови, клетки в культуре тканей и др. При суправитальном исследовании клетки помещают на предметное стекло в каплю физиологического раствора или специальной питательной среды, накрывают покровным стеклом и изучают под микроскопом.
Прижизненные исследования требуют применения специальных методик микроскопирования без использования красителей: фазовоконтрастная, темнопольная, поляризационная, люминесцентная, ультрафиолетовая микроскопия. Примером суправитального окрашивания моежт служить окрашивание бриллианткрезиловым синим ретикулоцитов крови, которое широко используется в клинике в качестве диагностического теста для оценки интенсивности кроветворения.
IV . Подготовка материала для электронно-микроскопического исследования
Подготовка к электронно-микроскопическому исследованию включает в себя те же этапы, что и при светооптической микроскопии, но с рядом особенностей.
Взятие материала необходимо проводить как можно быстрее, небольшими объемами (не более 1 мм3).
Фиксацию осуществляют, как правило, глутаральдегидом, хорошо стабилизирующим белки, с последующей дофиксацией в тетраоксиде осмия, который стабилизирует фосфолипиды, на холоде в течение нескольких часов. После фиксации материал промывают буферным раствором, обезвоживают спиртами возрастающей концентрации.
Уплотнение и заливку производят с помощью полимеризующейся смеси (эпоксидные смеси). Для этого образцы материала кладут в формы, заливают эпоксидной смолой и помещают в термостат, где происходит полимеризация смолы.
Для приготовления срезов (толщиной 30-50 нм) используют ультратомы, в которых подача блока с объектом на неподвижный нож осуществляется с помощью теплового расширения несущего стержня. В качестве ножей применяют специально приготовленные сколы стекла или алмазов. Получаемые при этом последовательные серийные срезы сползают с ножа в виде лент на поверхность жидкости в прикрепленной к ножу ванночке, откуда их надо перенести на сеточки.
Контрастирование (или окрашивание) срезов проводят с помощью солей тяжелых металлов (свинца, вольфрама, урана). Содержащиеся в этих соединениях элементы с высокой атомной массой осаждаются на фосфолипидах клеточных мембран и не пропускают электронный луч, вследствие чего эти участки клетки выглядят на экране более темными, контрастными по сравнению с другими участками, не содержащими фосфолипидов.
Для ориентировки в изучаемом объекте используют метод изготовления полутонких срезов (1-2 мкм) с последующим окрашиванием (метиленовым синим или олуидиновым синим). Окрашенный срез рассматривают с помощью микроскопа для определения области, которая должна быть изучена на ультрамикроскопическом уровне, и в дальнейшем с этого участка прицельно готовят ультратонкие срезы.
Практическая работа №2