Амидолитические методы с использованием хромогенных и флуорогенных субстратов

Дата: 2025-06-14; Просмотры: 1

Оценка:

0.00 из 5.00 — оценок

Скачиваний: 0

Скачать

Применение синтетических хромогенных суб­стратов явилось прорывом при исследовании от­дельных ферментов или ингибиторов, которые не учитываются простыми коагуляционными теста­ми или очень трудны для стандартизации. Во мно­гих случаях хромогенные субстраты являются спе­цифичными и позволяют определить протеолити-ческую активность отдельных компонентов плаз­менного гемостаза и их ингибиторов. Эти тесты схожи с тестами клинической химии, поэтому лег­ко автоматизируются и могут выполняться на био­химических анализаторах как в клинико-диагнос­тических, так и в научных лабораториях.

Принцип тестов с хромогенными субстрата­ми представлен на рис. 89. Протеаза расщепляет короткоцепочечный пептид (из 3-10 аминокис­лот), к которому через эфирную связь пришит хромоген (в нашем случае паранитроанилин -pNA). Комплекс пептид-pNA имеет максимум поглощения в области короткого ультрафиоле­та, свободный pNA - при 380 нм. Итоговая кон­центрация pNA пропорциональна активности протеазы и определяется по увеличению погло­щения светового пучка с длиной волны 405 нм.

Рис . 89. Принцип определения активности протеолити - ческого фермента ( протеазы ) с использованием хро - могенного субстрата . Максимум поглощения паранитро-анилина, связанного с пептидом, находится в области ко­роткого ультрафиолета, а свободного паранитроанилина -380 нм, При длине волны 405 нм поглощает практически толь­ко свободная форма хромогена, на этой длине волны про­водится регистрация протеолитической реакции

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Для оценки активности факторов гемостаза стали использовать флуорогенные субстраты, в

частности 7-амино-4-метилкумарин (АМК), кото­рый имеет максимум эмиссии при 440 нм. Флуо­рогенные субстраты обладают большей аналити­ческой чувствительностью и позволяют измерить специфическую активность компонентов гемо­стаза в большем диапазоне, чем хромогенные суб­страты. Они могут использоваться для определе­ния компонентов гемостаза, присутствующих в плазме в следовых концентрациях или обладаю­щих относительно низкой активностью.

Преимущества использования хромогенных и флуорогенных субстратов:

• Высокая чувствительность метода. pNA или
АМК обладают фотометрическими характе­
ристиками, позволяющими использовать ки­
нетические методы измерения.

• Высокая специфичность. Для каждой отдель­
ной сериновой протеазы системы гемостаза
известна структура участка гидролиза. Моде­
лирование в короткоцепочечном пептиде спе­
цифической для конкретной протеазы после­
довательности из 3 аминокислот позволяет
исключить влияние других протеаз на резуль­
таты исследования. При синтезе хромогенных
субстратов для повышения специфичности
используются L- или D-стереоизомеры амино­
кислот, а также различные блокирующие груп­
пировки, чтобы предупредить деградацию их

неспецифическими аминопептидазами. Кроме того, в тестах используется концентрация хро­могенных субстратов в несколько сотен мкмоль/л, что существенно выше, чем констан­та Михаэлиса (К_м) соответствующих фермен­тов, поэтому скорость реакции не зависит от концентрации субстратов. Факторы, которые необходимо учитывать при использовании хромогенных субстратов в практи­ческой клинико-диагностической лаборатории:

• Растворимость субстратов должна быть хо­
рошей.

• Реакция должна быстро достигать линей­
ность, чтобы использовать соответствующий
набор на биохимических анализаторах, в ко­
торых часто бывает ограниченным время
проведения измерения.

• В пробе не должно быть мутности, которую
часто привносит фибрин или денатурирован­
ные белки.

Недостатки метода с использованием хромо­генных субстратов:

• Высокая стоимость реактивов.

• Возможное завышение результатов при иссле­
довании активности витамин-К-зависимых фак­
торов у лиц, получающих непрямые антикоа­
гулянты либо имеющих дефицит витамина К.
Некоторые хромогенные субстраты, исполь­
зуемые для определения активности факторов
свертывания, представлены в табл. 16.

Таблица 16

Типичные хромогенные и флуорогенные субстраты и ингибиторы, применяемые для выявления активности протеолитических ферментов системы гемостаза

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Иммунохимические методы

Иммунохимические методы активно начали внедряться в клинико-диагностических лаборато­риях с целью исследования гемостаза в последнее десятилетие. Они позволяют количественно оп­ределять концентрацию конкретного белка, что отличает их от коагуляционных методов и мето­дов с хромогенными субстратами, в которых оп­ределяется функциональная активность компо­нентов, а не их концентрация. Первые тест-сис­темы не позволяли различить активные и неак­тивные (профакторы) компоненты системы гемо­стаза. В последнее время предлагается все боль­ше тест-систем для определения концентрации активных компонентов свертывания, их кофак­торов, активаторов, ингибиторов, продуктов про-теолитического гидролиза, а также сформировав­шихся субстрат-ферментных комплексов. Эти те­сты основаны на использовании специфических антител. В современных клинико-диагностичес­ких лабораториях доступными стали иммунохи­мические методы для ручного и автоматизирован­ного использования, основанные на латекс-агг­лютинации (рис. 90) и методе ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).

Латекс - агглютинация

Латекс-агглютинация выявляется визуально или на автоматизированных нефелометрах. Не-

достатком этого подхода является нелинейность оптического сигнала при турбидиметрическом и нефелометрическом методах регистрации.

Метод ELISA

Метод ELISA (рис. 91) для выявления кон­центрации факторов гемостаза, как правило, использует принцип «сендвича». На стенки мик­роплашки наносятся антитела к исследуемому фактору гемостаза (твердая фаза). После добав­ления плазмы происходит осаждение специфи­ческого антигена (белка системы гемостаза) на фиксированных антителах. Плашка промыва­ется и заполняется вторичными антителами, взаимодействующими с этим же белком, но по другим эпитопам (антигенным структурам). Вторичные антитела конъюгированы с фермен­том (ELISA), радиоактивной меткой (РИА), люминесцентной меткой (ЛИА). В тесте ELISA после отмывки несвязавшихся антител добав­ляется субстрат ферментативной реакции и хро­моген. Изменение светопропускания раствора пропорционально количеству антигена (факто­ра), осажденного на фиксированных антителах. Методика позволяет оценить этот параметр количественно в концентрации <1 нг/мл, что достаточно для многих компонентов свертыва­ющей системы.

Рис . 90. Принцип латекс - агглютинации . Латексные час­тицы, покрытые антителами против фактора гемостаза, при взаимодействии с этим фактором (антигеном) образуют агрегаты, видимые визуально или регистрируемые на со­ответствующих приборах

Рис . 91. Принцип ELISA . На плашке, покрытой антителами против фактора гемостаза, связывается антиген, Проявля­ющие антитела, конъюгированные с ферментом, связыва­ются с антигеном. Фермент меняет цвет хромогена про­порционально количеству антигена

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

В настоящее время значительное развитие получают быстрые качественные и полуколиче­ственные иммунохимические иммунодиффузион-ные методы, основанные на визуальном опреде­лении реакции антиген-антитело.

Радиальная иммунодиффузия

Метод радиальной иммунодиффузии (РИД) основан на образовании колец преципитации в результате взаимодействия специфических анти­тел, содержащихся в геле, с анализируемым ан­тигеном, помещаемым в углубления стандартно­го размера (рис. 92). В результате диффузии в геле растворимых антигенов кольцо преципитации образуется в зоне оптимального соотношения антиген/антитело. Площадь, ограниченная коль­цом преципитации, пропорциональна количеству антигена.

«Ракетный» иммуноэлектрофорез

«Ракетный» иммуноэлектрофорез - иммуноло­гический метод, сочетающий в себе электрофорез и иммунодиффузию (рис. 93). Метод дает возмож­ность различить сходные по электрофоретической подвижности вещества с помощью специфической реакции преципитации между антигеном, помеща­емым на гелевую (целлюлозо-ацетатную) пластин­ку, и соответствующими антителами, которые со­держатся в ней. Длина «ракетных» иммунопреци-питатов пропорциональна концентрации антиге­на. Метод довольно прост в исполнении и облада­ет относительно высокой точностью.

При фундаментальном подходе к исследовани­ям компонентов гемостаза применение флуоресцент­ной или люминесцентной меток повышает чувстви­тельность иммунохимических методов и расширяет спектр определяемых компонентов.

Рис . 92. Принцип метода радиальной иммунодиффу­зии ,

используемый для полуколичественной оценки неко- Рис . 93. Принцип метода «ракетный» иммуноэлектро -

торых факторов гемостаза форез

Скрининговые тесты оценки плазменного звена гемостаза

Лабораторная диагностика нарушений систе­мы гемостаза является одной из самых дорогосто­ящих в лабораторной практике. Выполнение всех возможных тестов для уточнения характера нару­шений для всех пациентов - практически недоступ­ная задача. Поэтому чрезвычайно важно соблю­дать этапность проведения тестов, исходить из клинических данных и анамнеза пациента.

На первом этапе для уточнения направленнос­ти нарушений необходимо провести тесты, отража­ющие состояние целых звеньев системы гемостаза. Поскольку в разных лабораториях при анализе ге­мостаза преследуются разные цели, перечень тестов, входящих в гемостатический скрининг для данной лаборатории, может отличаться от такового в дру-

гих лабораториях. Однако существует набор тестов, традиционно называемых (и рекомендуемых) скри-нинговыми для диагностики состояния системы ге­мостаза. Обычно к ним относят определение вре­ мени кровотечения и несколько тестов, оцениваю­щих состояние плазменного звена гемостаза, кото­рые входят как основной компонент в понятие коа- гулограммы. Наиболее полно этапность разработа­на для диагностики геморрагических нарушений. Скрининговые тесты:

• Время кровотечения.

• Количество тромбоцитов.

• АЧТВ.

• Протромбиновое время (по Квику).

• Тромбиновое время и/или фибриноген.

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Для пациентов с тромботическими заболева­ниями адекватного скрининга для диагностики нарушений системы гемостаза не разработано. Имеет смысл проведение исследования наиболее значимых маркеров тромбофилии, о которых бу­дет говориться ниже. Однако есть возможность контроля активности самого процесса патологи­ческого тромбообразования на основе анализа концентрации маркеров тромбообразования.

Скрининговые тесты на состояние внутренне­го и внешнего каскада активации протромбиназы позволяют выявлять нарушения со стороны фак­торов-субстратов, кофакторов, ингибиторов кас­када свертывания, а также действие некоторых

лекарственных препаратов или аутоантител. Ос­новным тестом на состояние внутреннего каскада свертывания плазмы является АЧТВ, на состояние внешнего каскада - ПВ. Их диагностическое зна­чение представлено в табл. 17 и на рис. 94.

Несмотря на то что в тестах АЧТВ и ПВ уча­ствует большинство плазменных факторов, дале­ко не во всех случаях при патологии того или иного звена или действии лекарственных препа­ратов эти показатели меняются (табл. 18). Коагу-лограмма - это комплексный анализ по многим тестам, совокупность которых может позволить определить конкретную причину нарушения свер­тывания крови.

Таблица 17

· Концентрация фибриногена начинает влиять на результаты тестов при снижении ее ниже определенного порога. Как правило, эти тесты не позволяют количественно определить фибриноген или заподозрить уме­ренное снижение его концентрации.

Рис . 94. Факторы , влияющие на результаты скрининговых тестов АЧТВ и ПВ . Звездочкой зависимые факторы, на которые влияют антикоагулянты непрямого действия

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Таблица 18

Изменение А ЧТВ и ПВ при патологии отдельных компонентов плазменного звена гемостаза

и влиянии некоторых лекарственных средств

В названии АЧТВ (иногда его обозначают как активированное парциальное тромбопласти­новое время, АПТВ) слово «частичное», или «пар­циальное», указывает на то, что в тесте использу­ются реагенты, содержащие фосфолипиды, а не тканевые факторы (в этом отличие от ПВ, где используется тканевой тромбопластин). Факто­ры и взаимные влияния некоторых из них на АЧТВ представлены на рис. 95.

АЧТВ используется как скрининговый тест для оценки внутреннего каскада свертывания плазмы, скрининговой диагностики волчаночно­го антикоагулянта и слежения за антикоагулянт-ным действием гепаринов. АЧТВ - более значи­мый тест для первичного выявления патологии,

чем ПВ, так как выявляет относительно часто встречающуюся гемофилию А и В (дефицит фак­торов VIII и IX соответственно) и наличие вол­чаночного антикоагулянта.

Лабораторные условия , влияющие на АЧТВ

Нормальные значения теста АЧТВ зависят от используемых реактивов и приборов. Большое значение имеет преаналитическая стадия: прини­маемые пациентом лекарственные препараты, правильность взятия крови, использованный ан­тикоагулянт, условия хранения и транспортиров­ки пробы и т. д. Охлаждение пробы ведет к акти­вации контактной фазы in vitro . Стабильность

■

109

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Рис . 95. Последовательные и взаимовлияющие реак­ции , определяющие значение активированного частично­го тромбопластинового времени (АЧТВ)

пробы зависит от применяемых пробирок. Поэто­му каждая лаборатория должна нарабатывать собственные нормы. До настоящего времени практически нет системы межлабораторной стандартизации теста АЧТВ, приборная и реа-гентная база этого теста пока не поддаются стан­дартизации. Рекомендуется корректировать нор­мы для каждой серии реактивов. Опытным пу­тем следует удостовериться в качестве АЧТВ-реактивов, которые должны отвечать следую­щим критериям:

• Иметь одинаковые диапазоны нормальных
значений для разных серий реактивов от од­
ного производителя.

• Должны выявлять клинически значимое сни­
жение факторов свертывания удлинением
времени образования сгустка (т. е. результа­
ты должны соответствовать клиническим
проявлениям гипокоагуляции).

• Быть чувствительными к антикоагулянтному
эффекту гепарина, при этом не проявлять
слишком высокой чувствительности при ис­
пользовании гепарина в терапевтической
концентрации.

• Выявлять наличие волчаночного антикоагу­
лянта, для этого рекомендуется использовать,
в частности, 2 набора с разной чувствитель­
ностью к волчаночному антикоагулянту.

Предпочтительно использовать готовые ре­активы, что уменьшает ошибку оператора.

Время преинкубации в тесте АЧТВ имеет большое значение для выявления патологии ге­мостаза. При коротком времени от момента до­бавления активаторов (каолин и кефалин) до момента внесения СаС1₂ тест АЧТВ получается достаточно длительным и нестабильным. Опыт показывает, что 30 с преинкубации недостаточ­но, однозначные стабильные результаты гаран­тированно получаются после 600 с преинкуба­ции. Однако такая длительная преинкубация не­технологична. Общепринятой считается преин­кубация 60 с, при которой нестабильность не приводит к искажениям результатов, которые бы значимо влияли на диагностические характери­стики теста.

Тем не менее при дефицитной плазме по од­ному из факторов контактной фазы (XII, XI, пре-калликреин, ВМК), особенно прекалликреину, длительная фаза преинкубации с активаторами создает условия для нивелирования результатов. Только при коротком периоде преинкубации в этих условиях удается выявить дефицит фактора, при 60-минутной преинкубации часто дефицит факторов контакта не выявляется. Результаты будут ложно «нормальными», что ведет к оши­бочному диагнозу.

Диагностическое значение АЧТВ

Укорочение А ЧТВ иногда определяется у боль­ных с тромбофилией. Это может быть связано с ре-зистентностью фактора V к активному протеину С, повышенным уровнем фактора VIII или активи­рованных факторов свертывания. Однако чаще всего укорочение АЧТВ объясняется нарушения­ми работы с кровью на преаналитическом этапе.

Удлинение А ЧТВ происходит при:

• врожденном или приобретенном дефиците
факторов II, V, VIII, IX, X, XI, XII, прекал-
ликреина, ВМК;

• снижении активности ф-VIII на фоне болез­
ни Виллебранда;

• лечении гепарином, гирудином или апроти-
нином (ингибитор контактной фазы коагу­
ляции);

• присутствии в крови ПДФ, волчаночного
антикоагулянта;

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

• нарушении функции печени;

• коагулопатии потребления (ДВС-синдром);

• тяжелой дисфибриногенемии или афибрино-
генемии.

Важно подчеркнуть (обычно это не учитыва­ется), что при хранении снижается стабильность пробы, особенно от больных, которым вводился гепарин. В результате резко увеличивается вари­ация данных АЧТВ, регистрируемых подряд из одной пробы.

Реактивы, используемые для постановки АЧТВ, не стандартизуются. Поэтому свойства реактивов должны быть известными, лучше пользоваться реактивами от одного производи­теля. Набор реактивов для АЧТВ содержит ак­тиватор контактной фазы и фосфолипиды. СаС1₂ добавляется в пробу отдельно как стартовый ре­актив. Контактный активатор - это высокодис­персионная суспензия отрицательно заряженных частиц каолина (белая глина) или эллаговая кис­лота, полифенол или сульфатиды (отрицательно заряженные сульфатированные липиды) в смеси с каолином. Фосфолипиды используют или син­тетические, или выделенные из тканей живот­ных (мозг кролика) или из сои. Лучшие результа­ты достигаются при использовании смеси разных фосфолипидов, включая отрицательно заряжен­ный фосфатидилсерин. Вид и концентрация фос­фолипидов - более важный компонент для харак­теристики набора АЧТВ, чем компоненты кон­тактной фазы активации. Стабилизация реакти­ва обеспечивается в первую очередь ионной си­лой раствора и свойствами буферной системы, это во многом влияет на коагуляционные свойства АЧТВ-реактива.

Чувствительность теста А ЧТВ к разным из­менениям гемостаза в значительной мере связана со свойствами используемых в тесте реактивов. Большинство тест-наборов АЧТВ (но не все) чув­ствительно к снижению активности факторов VIII или IX. Однако умеренное снижение активности ф.IХ может не вызывать удлинения АЧТВ при вы­сокой активности ф.VIII, несмотря на наличие ге­моррагических проявлений у пациента. При дефи­ците других факторов чувствительность теста зна­чительно варьирует, однако при остатке фактора <10% нормы АЧТВ во всех случаях удлиняется.

Фактор VIII является острофазным белком, повышается при воспалительных реакциях, трав-

мах. Данный факт необходимо учитывать при ин­терпретации укорочения АЧТВ в этих случаях. АЧТВ - менее чувствительный тест на выявление патологии на общем этапе коагуляции и недоста­точности фибриногена, чем ПВ.

Чувствительность АЧТВ к волчаночному ан­тикоагулянту варьирует в зависимости от реак­тива (от полного отсутствия удлинения АЧТВ до значительного удлинения).

В присутствии ПДФ происходит значитель­ное удлинение АЧТВ (рис. 96). Следует отметить, что ингибирующий эффект зависит от использу­емых реактивов для определения АЧТВ.

Рис . 96. Изменение АЧТВ из - за накопления ПДФ при ле­чении стрептокиназой тромбоза глубоких вен бедра. Уд­линение АЧТВ значительно превысило референтный диа­пазон, Результат нельзя объяснить снижением активности отдельных факторов гемостаза. Эффект связан с прямым действием ПДФ на полимеризацию фибрин-мономеров