Тема 10. Физико-химические методы анализа
Химические методы изучения органических веществ играют в биохимии важную роль, но применение физических методов, особенно в последнее время, приобрело исключительно важное значение.
При изучении сложных веществ, крайне нестойких даже к мягким воздействиям, физические методы особенно необходимы, так как они, в отличие от химических, в большенстве своем не изменяют изучаемых веществ.
Применение физических методов в настоящее время в ряде случаев во много раз сокращает объем химических исследований, необходимых для изучения строения неизвестных веществ.
Физические методы позволяют изучить такие тонкие особенности и детали строения органических веществ, которые вообще невозможно выяснить химическими методами. Такими деталями являются: расстояние между центрами атомов в молекулах, взаимное расположение в пространстве отдельных частей молекулы, природу химических связей и т.п. характеристики.
Эти методы широко используются для количественных и качественных исследований биологических систем на молекулярном уровне.
Очень многие физико-химические характеристики биологических жидкостей, такие как светопоглощение, величина угла вращения плоскости поляризации, электропроводность и др., находятся в зависимости от концентрации вещества. Таким образом, измеряя эти величины, мы можем определить количество вещества в анализируемом растворе. Все эти методы носят название физико-химических методов анализа.
Физико-химические методы анализа в основном имеют меньшую точность, чем химические методы. Точность большинства физико-химических методов ±5%. Основу физико-химического анализа составляют фотометрические и электрометрические методы.
В фотометрических методах используют зависимость между составом, количеством вещества и его светопоглощением, светорассеянием, преломлением света (рефракцией), вращением плоскости поляризации, люминесценцией.
Электрометрические методы анализа основаны на измерении различных электрических характеристик вещества (изменение электропроводности, электрического потенциала, величины силы тока).
Физико-химические методы широко применяются при клинических, санитарно-гигиенических и фармацевтических анализах. Фотометрически определяют содержание гемоглобина и сахара в крови, холестерина, общего белка, остаточного азота, содержание аммиака, железа и нитритов в воде при оценке качества питьевой воды. Анализ некоторых фармацевтических препаратов также основан на фотометрических методах. Нефелометрия применяется для оценки загрязнения воздуха вредными примесями на производстве, определения содержания свинца и ртути. Поляриметрия используется для определения количества сахара в моче. При анализе безалкогольных напитков количество сахара также определяют с помощью поляриметрии.
Оптические методы
Главное преимущество оптических методов состоит в том, что вещество в процессе исследования не разрушается. Кроме того, методики исследований легко модифицировать и автоматизировать. Оптические методы позволяют обнаруживать незначительные количества вещества даже в довольно сложных системах. В последнее время в практике все шире применяют атомно-адсорбционную, инфракрасную и масс-спектроскопии.
Типы спектров и их применение в биологии.
Спектр представляет собой зависимость количества поглощенной или излученной системой энергии от длины волны или другого параметра, например волнового числа.
Молекулы взаимодействуют с излучением в широком диапазоне длин волн, поэтому их спектры лежат в разных областях. Для измерения в каждом спектральном диапазоне используется специальное оборудование. Одни типы спектров можно получить довольно легко и, соответствующие методы широко используются биохимикатами в повседневной работе. Однако есть область спектроскопии, где применяется довольно сложное оборудование. Соответствующие методы используются лишь для детального исследования биологических макромолекул и других субклеточных структур. Электронные спектры обусловлены переходом электронов наружных оболочек атомов с одного энергетического уровня на другой и спектры занимают видимую и ультрафиолетовую области.
Сущность фотометрических методов.
При фотометрических определениях интенсивность окраски или степень мутности определяемого раствора сравнивают с окраской раствора, концентрация которого известна.
Для того, чтобы вещество можно было определить фотометрически, проводят цветную реакцию и получают окрашенный раствор. Для этой цели применяют реакции окисления-восстановления, комплексообразования, органического синтеза. Цветные реакции, применяемые в фотометрии, должны удовлетворять следующим требованиям.
1. Реакция получения окрашенного раствора должна протекать с большой скоростью.
2. Полученное окрашенное соединение должно обладать достаточно интенсивной окраской; чем интенсивнее окраска, тем чувствительнее метод анализа.
3. Окраска должна быть устойчивой во времени и малочувствительной к свету. Интенсивность окраски не должна изменяться с изменением температуры и рН раствора. Если рН раствора оказывает заметное влияние на интенсивность окраски, проведение цветной реакции должно происходить при строго определенной величине рН.
4. Интенсивность окраски должна быть прямо пропорциональна концентрации окрашенного соединения.
5. Раствор данного окрашенного соединения должен подчиняться закону Ламберта-Бэра. Чтобы уменьшить отклонения от закона Ламберта-Бэра, необходимо работать в оптимальных условиях, выбрав подходящие реагент и способ приготовления окрашенных испытуемого и стандартного раствора.
Для того, чтобы приготовить окрашенный раствор известной концентрации, применяют так называемые стандартные растворы, которые содержат точно известное количество определяемого вещества. Обычно концентрация стандартного раствора выражается в миллиграммах вещества в миллилитре раствора (мг/мл). Стандартные растворы готовят обычно по точно взятой навеске, если взвешиваемое вещество удовлетворяет требованиям, предъявляемым к веществам, из которых можно приготовить растворы точной концентрации. Для приготовления стандартных растворов с меньшей концентрацией (стандартный ряд) отбирают определенный объем (аликвоту) приготовленного раствора, переносят в мерную колбу и доводят водой до метки. Если невозможно приготовить раствор по точной навеске, готовят раствор по приблизительной навеске. В этом случае готовят гораздо более концентрированный раствор, чем это необходимо для фотометрических определений. Растворы нужной концентрации готовят разбавлением приготовленного раствора.
При приготовлении окрашенных растворов необходимо придерживаться следующих правил.
1. К стандартному и испытуемому растворам прибавляют одинаковые реактивы в одной и той же последовательности и в одних и тех же количествах.
2. Окрашенные растворы, стандартный и испытуемый, готовят одновременно, так как часто интенсивность окраски изменяется со временем.
3. Окрашенные растворы, стандартный и испытуемый, должны быть одинакового объема. Поэтому окрашенные растворы готовят в мерных колбах или в градуированных пробирках.
4. Окраску испытуемого и стандартного раствора сравнивают в одинаковых условиях.