Первичная структура нуклеиновых кислот
1. Этапы развития молекулярной биологии. Доказательства роли нуклеиновых кислот (опыты Ф.Гриффита, О.Эвери, К.Маклеуд, М.Макарти, А.Херши, Ф.Конрата)
Этапы развития:
I . Романтический период 1935-1944 гг.
Макс Дельбрюк и Сальвадор Лурия занимались изучением репродукции фагов и вирусов, представляющих собой комплексы нуклеиновых кислот с белками. В 1940 г. Джордж Бидл и Эдуард Татум сформулировали гипотезу - "Один ген - один фермент". Однако, что такое ген в физико-химическом плане тогда еще не знали.
II . Второй романтический период 1944-1953 гг.
Доказана генетическая роль ДНК. В 1953 г. появилась модель двойной спирали ДНК, за которую ее создатели Джеймс Уотсон, Френсис Крик и Морис Уилкинс были удостоены Нобелевской премии.
III . Догматический период 1953-1962 гг.
Сформулирована центральная догма молекулярной биологии: перенос генетической информации идет в направлении: ДНК è РНК è белок. В 1962 году расшифрован генетический код.
IV . Академический период с 1962г. по настоящее время, в котором с 1974 года выделяют генно-инженерный подпериод. Основные открытия:
1944г. – доказательство генетической роли ДНК. Освальд Эйвери, Колин Мак-Леод, Маклин Мак-Карти;
1953г. – установление структуры ДНК. Джеймс Уотсон, Френсис Крик;
1961г. – открытие генетической регуляции синтеза ферментов;
1962г. – расшифровка генетического кода. Маршал Нирнберг, Генрих Маттеи, Северо Очоа;
1967г. – синтез in vitro биологически активной ДНК. Артур Корнберг (неформальный лидер молекулярной биологии);
1970г. – химический синтез гена. Гобинд Корана;
1970г. – открытие фермента обратной транскриптазы и явления обратной транскрипции. Говард Темин, Дэвид Балтимор, Ренато Дульбеко;
1974г. – открытие рестриктаз. Гамильтон Смит, Даниэль Натанс, Вернер Арбер;
1978г. – открытие сплайсинга. Филипп Шарп;
1982г. – открытие автосплайсинга. Томас Чек.
Доказательства:
1. Ф.Гриффит (1928 г.)
Гриффит работал с пневмококками - бактериями, вызывающими пневмонию. Он брал два штамма пневмококков: капсульный и бескапсульный. Капсульный - вирулентный, при инфицировании таким штаммом мыши погибают, бескапсульный - непатогенный. При введении мышам смеси убитых нагреванием (и, следовательно, потерявших вирулентность) капсульных пневмококков и живых бескапсульных невирулентных бактерий, животные погибали в результате размножения капсульных вирулентных форм. Обнаруженное явление Гриффит интерпретировал как трансформацию. Вывод: от убитых вирулентных бактерий к живым авирулентным передается трансформирующий фактор, превращающий авирулентные штаммы в вирулентные.
2. О.Эвери, К.Маклеуд, М.Макарти (1944 г.)
Доказали, что трансформирующим фактором является ДНК. Это было показано в опыте с использованием трех ферментов – протеазы, рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы, разрушающих соответственно белки, РНК и ДНК, причем только в последнем случае трансформирующая активность исчезала. Трансформирующий фактор взаимодействует с невирулентными клетками, включая ряд метаболических реакций, приводящих к синтезу полисахарида капсулы.
3. А.Херши, Ф.Конрата (1952 г.)
Исследовали бактериофага Т2, инфицирующий E. coli. Было известно, что фаги Т2 состоят наполовину из белков, наполовину из ДНК. В эксперименте белки метили радиоактивной серой (S35), ДНК – радиоактивным фосфором (P32), поскольку белки не содержат фосфора и ДНК серы. Оказалось, что при лизисе инфицированных меченым фагом бактерий освобождалось потомство, меченное фосфором, т.е. белковая оболочка фага остается снаружи бактериальной клетки-хозяина, а для образования вирусных частиц важна только вирусная ДНК – генетический материал фага Т2.
2. Структура молекул ДНК
Первичная структура нуклеиновых кислот
Нуклеотиды в нуклеиновых кислотах связаны 3′,5′-фосфодиэфирной связью, которая возникает между 3′-ОН группой углевода одного нуклеотида и 5′-ОН группой углевода другого нуклеотида. Связи в молекуле НК: 5′-фосфоэфирная; N-гликозидная; 3′,5′-фосфодиэфирная. Чтение последовательности в направлении 5′è3′.
Вторичная структура ДНК (правила Чаргаффа)
Количество пуриновых оснований равно количеству пиримидиновых оснований: А + Г = Ц + Т или (А + Г)/(Ц + Т)=1.
Количество аденина и цитозина равно количеству гуанина и тимина: А + Ц = Г + Т или (А + Ц)/(Г + Т)=1.
Количество аденина равно количеству тимина, а количество гуанина равно количеству цитозина: А = Т и Г = Ц или А/Т=1; Г/Ц=1.
Коэффициент специфичности, который отражает (Г+Ц)/(А+Т). Для эукариот этот коэффициент <1 (0,54 – 0,94), для прокариот >1.
В соответствии с моделью Дж. Уотсона и Ф.Крика, молекула ДНК состоит из 2-х цепей, образуя правовращающую спираль, в которой обе полинуклеотидные цепи закручены вокруг одной и той же оси. Удерживаются полинуклеотидные цепи водородными связями, образующимися между комплементарными азотистыми основаниями: между А и Т – две водородные связи, Ц и Г – три водородные связи. Азотистые основания расположены внутри спирали, а фосфорные остатки и углеводные компоненты – снаружи. Кроме водородных связей в стабилизации молекулы ДНК принимают участие силы гидрофобного взаимодействия, образующегося между плоскостями оснований внутри двойной спирали ДНК. Обе цепи в молекуле ДНК имеют противоположную полярность (антипараллельны). Это означает, что одна цепь имеет направление 5'→ 3', а другая 3'→5'. Подобная направленность цепей играет важную биологическую роль при репликации и транскрипции молекулы ДНК. В настоящее время известны А, В и Z-формы ДНК. При физиологических условиях доминирующим структурным типом ДНК является В-форма. Расстояние между витками спирали (или шаг спирали) - 3,4 нм. На этом участке укладывается 10 нуклеотидных остатков, размер 1 нуклеотида - 0,34 нм, диаметр биспиральной молекулы -1,8 нм. В структуре ДНК различают большую и малую бороздки, закрученные вокруг оси молекулы параллельно фосфодиэфирному остову. В этих бороздках белки могут специфически взаимодействовать с определенными атомами нуклеиновых оснований. В молекуле ДНК встречаются последовательности, которые называются палиндромами.