Техника посева и инкубации
После предварительной обработки материал центрифугируют, за счёт этого осаждают микобактерии и повышают их содержание в осадке («обогащение осадка»). Полученный осадок подвергают нейтрализации и засевают им (инокулируют) поверхность плотных питательных сред или пробирки с жидкими (полужидкими) средами. Из оставшейся части осадка готовят мазки для микроскопического исследования. Техника посева должна предотвращать кросс-контаминацию диагностического материала.
Для достоверной клинической интерпретации результатов микробиологического исследования необходимо соблюдать следующее правило: микроскопическое и кулътуральное исследования нужно производить параллельно из одной и той же пробы диагностического материала.
Инокулированные пробирки помещают в термостат при 37 ˚С на 2 сут в горизонтальном положении. Это обеспечивает более равномерное всасывание материала в питательную среду. Через 2 сут пробирки переводят в вертикальное положение и герметично закрывают резиновыми или силиконовыми пробками во избежание подсыхания засеянных сред.
Посевы выдерживают в термостате при 37 °С в течение 10-12 нед при регулярном еженедельном просмотре. При каждом контрольном просмотре регистрируются следующие параметры:
• срок визуально наблюдаемого со дня посева роста;
• интенсивность роста (число КОЕ);
• загрязнение посева посторонней микробной флорой или грибами (такие пробирки удаляют);
• отсутствие видимого роста. Пробирки оставляют в термостате до следующего просмотра.
ОЦЕНКА И УЧЁТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПОСЕВА
ДИАГНОСТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
Некоторые штаммы и виды микобактерий растут медленно, рост может появляться даже к 90-му дню. Число таких культур невелико, но это заставляет выдерживать посевы в термостате в течение 2,5-3 мес.
Вирулентные культуры микобактерий туберкулёза обычно растут на плотных яичных средах в виде R-форм колоний различной величины и вида. Колонии сухие, морщинистые, цвета слоновой кости, слегка пигментированные. На других средах колонии микобактерий туберкулёза могут быть более влажными. После курса химиотерапии или в процессе лечения могут выделяться гладкие колонии с влажным ростом (S-формы).
Интенсивность роста микобактерий обозначают по следующей схеме:
(+) - 1-20 КОЕ в пробирке (скудное бактериовыделение);
(++) — 20-100 КОЕ в пробирке (умеренное бактериовыделение);
(+++) — >100 КОЕ в пробирке (обильное бактериовыделение).
В последние годы для ускорения роста микобактерий предложены питательные среды на агаровой основе с различными ростовыми добавками и применением специальной газовой смеси. Для получения роста микобактерий на этих средах при культивировании создают атмосферу с повышенным содержанием углекислого газа (4-7%). С этой целью используют специальные С02-инкубаторы. Однако наибольшее развитие получили автоматизированные системы культивирования микобактерий: MGIT-BACTEC-960 и MB/Bact.
Одна из таких систем— система MGIT ( mycobacteria growth indicating tube), которая относится к разработкам высоких технологий и предназначена для ускоренной бактериологической диагностики туберкулёза и определения чувствительности микобактерий к препаратам первого ряда и некоторым препаратам второго ряда. MGIT ориентирована на использование её в составе прибора ВАСТЕС-960. Культивируют микроорганизмы в специальных пробирках с жидкой питательной средой на основе модифицированной среды Middlebrook-7Н9. Для стимуляции роста микобактерий и подавления роста посторонней микрофлоры используются добавки роста MGIT Growth Supplement и смесь антибактериальных препаратов PANTA.
Регистрацию роста микроорганизмов осуществляют оптически. В её основе лежит флюоресценция, возникающая при потреблении кислорода микобактериями в процессе роста. Кислородзависимый флюорохромный краситель содержится на дне специальной пробирки и покрыт слоем силикона. Размножение микобактерий приводит к уменьшению количества кислорода в пробирке и снижению его концентрации, что вызывает усиление флюоресценции, которая становится видимой при облучении пробирки ультрафиолетовым светом и автоматически регистрируется фотодатчиками, встроенными в прибор ВАСТЕС-960. Интенсивность свечения регистрируют в единицах роста (GU— growth units). Данные роста заносятся в компьютер, где их можно сохранить, автоматически. Компьютерный анализ кривых роста может дать информацию о наличии различных пулов микобактерий, в том числе нетуберкулёзных, а также помогает оценить ростовые свойства микобактерий. В результате внедрения таких систем время появления роста микобактерий значительно сократилось, составляя в среднем 11 дней на ВАСТЕС-960 и 19 дней на MB/Bact против 33 дней на стандартной плотной питательной среде. Необходимо отметить, что эти системы требуют высокой квалификации персонала. Посев материала на жидкие среды обязательно сопровождают посевом на среду Левенштейна-Йенсена, играющую роль дублёра в тех случаях, когда на других средах микобактерий туберкулёза не дают роста.