2. длительное хранение спермы - замораживание в жидком азоте - быка, жеребца Т -196 С.
1. хранение спермы в бикарбонатно - фосфатной среде. Еще в 1924 - 34 гг. советские исследователи предлагали возможность хранения спермы при комнатной т путем применения углекислотной инактивации, но среды такой не было создано. Ван-де Марк в 1956 г. - американскому ученому удалось создать среду в которой сперма сохранялась при Т 20 С и оплодотворяемость 76 %. Для приготовления среды ИВТ необходимо газообразная двуокись углерода и степень его насыщения. Нужно строго контролировать при помощи потенциометра со стеклянным электродом и предохранять среду от потери угольной кислоты, как в процессе работы так и при хранении. Это очень сложно. И советские ученые во главе с В.К. Миловановым предложили компоненты образующие угольную кислоту. Такими компонентами явились: однозамещенный фосфат К и бикарбонат Na при помощи слабой кислоты (однозамещенного фосфата калия) можно получить угольную кислоту: химическая реакция NaHCO3 + KH2PO4 = NaKHPO4 + H2CO3
Образующаяся угольная кислота при Т 20 С и N атмосферном давлении остается в растворенном состоянии и не выделяется в виде газообразной двуокиси вызывая замедление обменных процессов за счет смещения рН в кислую сторону. Основным механизмом является кислотная инактивация С.
Бикарбонатно - фосфатная среда
Дист.вода - 1000 мл
Na лимонно-кислый 3х замещенный 5ти водный - 20 гр.
Фруктоза - 11,5 гр.
Бикарбонат Na - 0,9 гр.
К фосфорно кислый однозамещ.- 3,25 гр.
Спермосан -3 - 250 м.ед.
При более низких Т - жкя - 100 мл.
Среда готовится перед получением спермы. Все компоненты растворяются в 900 мл воды + жкя и в 100 мл отдельно растворяют фосфорно-кислый К. перед разбавлением растворы смешивают. Среда рН 6,5 т.е. слабо кислая и сперма сохраняется в течение 3-4 дней хорошо. Разбавляют сперму постепенно, не подогревая среду, чтобы не улетучилась угольная кислота.
Хранят сперму в ампулах запаянных или флаконах. Т хранения 10-15 С. В жаркие дни хранят в подвалах и погребах. Перевозить можно в картонных коробках, опилках, в вате и т.д., в бочках с холодной водой. Т.е. хранение спермы быков без охлаждения в бикарбонатно-фосфатной среде не требует расходов на приобретение дорогостоящих термосов, а обычные посылочные ящики.
2. Г-Ц-Ж среда
3. Молочно-желточная среда - 100 мл молока, 20 мл - жкя, антибиотики.
Для барана
ГЦЖС (Т 2-4С)
Вода - 100 мл
Глюкоза - 0,8 мл
NaЛК - 2,8 мл
Жкя - 20 мл
Спермосан - 3 - 250 м.ед
Глюкозо-фосфат-желточный разбавитель (Т 2-4 С)
Дист.вода - 100 мл
Глюкоза - 3,2
К фосфор. Кисл. Однозам.- 0,08 гр
К фосфорн. Кислый 2х замещ. 12 водн. - 2,08
Спермосан - 3 - 250 м.ед
В таких средах сперма сохраняется 24-36 часов.
Синтетическая среда для разбавления спермы хряка.
Для разбавления спермы хряка применяют среды с хелатоном и хранят при комнатной Т.
А среды, которыми разбавляют сперму быка и барана спермы хряка вызывают снижение оплодотворяющей способности, причины пока не установлены, но предварительно считают, что происходят деструктивные изменения С, отслаивается акросома. Среда с хелатоном для разбавления спермы хряка была предложена Ван -де - Марком 1966 г. США,
Синтетическая среда
Глюкозо - хелато - цитратная при Т 16-20 С ГХЦС
Вода дист. - 1000 мл
Глюкоза мед. Безв. - 40 гр.
Na лим.кисл. 3х замещ. 5 водн. - 3,8 гр.
Бикарбонат натрия - 0,5 гр.
Хелатон (трилон Б) - 2,6
Спермосан - 3 - 500 тыс.ед.
Аммоний сернокислый очищен. - 1,8
Хелатон обладает способностью временно связывать ионы металлов вследствие чего тормозится активность ферментов и снижается уровень обменных в-в в сперме. С находятся в состоянии анабиоза и сохраняют высокую оплодотворяющую способность в течение 2-3 (4-5) суток. Хелатон применяли в средах для разбавления спермы быка придавали этому большое значение, но для быка этот способ не получил широкого распространения.
Оборудование не сложно. Ящик с опилками.
При фракционном способе осеменения свиноматок сперму разбавляют глюкозо-солевым раствором.
Вода дист. - 1000 мл
Глюкоза - 30 гр.
Соли - 4 гр.
Солевым раствором
Вода дист. - 1000 мл
NaСl - 9 гр.
А так же свежее прокипячённое обезжиренное молоко от здоровых коров.
Как вы заметили к среде для разбавления спермы хряка жкя для смягчения холодового удара не добавляется. Все авторы занимавшиеся исследованиями по хранению спермы хряков при пониженных плюсовых т (0-5 С) отметили высокую чувствительность спермиев этого вида ж-х к сравнительно быстрому охлаждению. Одним из основных способов защиты спермиев от гибели в результате холодового удара - замедленное охлаждение спермы, при этом уменьшается осмотический градиент на границе клетки со средой.
Синтетическая среда для разбавления и хранения спермы жеребца
Глюкозо - желточный разбавитель (хр. Т 0 С)
Вода дист. - 100 мл
Глюкоза мед. безводная. - 7 гр.
Желток куриного яйца - 0,8 мл
Синтетическая среда для немедленного использования осеменения кобыл
Глюкозовый разбавитель
Вода дист. - 100 мл
Глюкоза безвод. - 7 мл
Вода дист. - 100 мл
Сахар рафинад - 11 гр.
Медовый
Вода дист. - 100
Медь - 10,0
Жкя - 0,75 мл
Разбавленную сперму расфасовывают:
Для быка - стерильные стеклянные одноразовые ампулы, пробирки 1 мл, флаконы из под пенициллина, бумажные капсулы - заполняют
С помощью дозирующего аппарата или стерильным шприцом с иглой нержавеющей стали. По окончании расфасовки одного производителя все тщательно моется, ополаскивается разбавителем и приступают к расфасовки спермы др. производителей. Все емкости заполняются полностью до горлышка во избежания взбалтывания и вспенивания снижающих жизнь С. Флаконы сразу же закрывают пробками из белой нетоксичной резины и прикрепляют этикетки: кличка, номер, дата, часы взятия спермы.
Сперму барана - расфасовывают в стеклянные ампулы емкостью 2-5 мл или инсулиновые флаконы.
Сперму хряка - сохраняют в стеклянных колбах или полиэтиленовых флаконах, которые закрывают не герметично целлофаном или пергаментной бумагой. Дозы расфасовки 100-200-500 мл.
Сперму жеребца - расфасовывают в баночки с притертыми пробками емкостью - 50-100 мл. На всех емкостях или этикетки которые прикрепляются к сперме должно напечатано при помощи маркировочной машины или написано тушью: кличка, номер, дата взятия спермы.
Расфасованную сперму, остужают постепенно равномерно - замедленно, во избежание холодового шока, при резком снижении Т. Завертываются в 2-3 слоя ваты 1,5-2 см толщиной помещают в стеклянную банку и ставят в погреб (ведро, кадку) со льдом или снегом через 3-4 часа сперма охлаждается до 0 (1-3) градусов не подвергаясь Т шоку. Или колется мелко лед и заполняется сосуд ? объема целлофана вата ампулы со спермой, затем сверху и с боков ? объема льда. Лед должен находиться в фазе таянья. При кратковременном хранении разбавлению сперму быка можно хранить 3-4 суток барана - 24-36 часов, жеребца 24-36 часов. По каким-то причинам свежеполученная сперма не израсходована при обычных условиях храниться от быка, барана 3 ч, от хряка, жеребца 1 ч., не израсходованную сперму быка и барана можно хранить при Т 0-3 градуса 8-10 часов при условии если активность будет 7 баллов. Хранение спермы хряка и жеребца 6-8 ч не допускается. При Т 0 градусов у С резко понижается обменные процессы, прекращается расходование пластических в-в из протоплазмы, медленно изменяется рН - среды, в результате чего они дольше живут во внешней среде и сохраняют оплодотворяющую способность. Кроме этого при Т 0 градусов задерживается рост и развитие микробов попавших в сперму при взятии, разбавлении, расфасовки. И к тому же лед является наиболее доступным, дедовым и эффективным хладагентом. При таянии мед устойчиво поддерживает Т. Для хранения спермы таким способом нужно иметь специальные пенопластовые, поролоновые или стеклянные (пищевые) термосы. Пробирки со спермой обычно помещают в средину льда а не сверху. Сначала на половину заполняют льдом затем ложится целлофан, опускаются вата непроницаемые мешочки в которых находится сперма мешочки завязаны прочной ниткой для извлечения мешочка из термоса. С боков и сверху должен быть лед. Если Т -5 градусов, то термосы ставят в войлочные чехлы, если Т - 20 градусов, то в термосы вместо льда наливается вода Т -5-8 градусов, такой термос можно держать на морозе 2-3 суток т.е. пока не замерзнет 2/3 объема воды в термосе, крышку смазывают вазелином, чтобы она не примерзла.
Установлено, что если поставленные непосредственно на лед флаконы со спермой, разбавленной желточной средой охлаждаются до 0 градусов быстрее, чем за 1 час, то это ведет к заметному холодовому удару или к сокращению срока жизни С и снижению оплодотворяющей способности их. Если же разбавленная сперма до охлаждения ее на льду до 0 градусов находилась некоторое время при комнатной Т, то переживаемость С в такой сперме намного лучше. Поэтому в практике при охлаждении спермы до 0, некоторое время в течении 30-60 минут выдерживают при комнатной Т. В это время разбавляют и расфасовывают сперму и готовят к упаковке. Если при комнатной температуре продержали сперму больше 60 минут, это отрицательно отражается на ее качестве, т.к. при этом происходит активное движение спермиев, вследствие чего в сперме накапливается молочная кислота и другие продукты обмена, ведущие к ослаблению и гибели С.