1. во-первых сперму нужно разбавлять как можно быстрее при ее получении (5-10 мин)
Разбавление спермы
1. первоначальные разбавители и их значение
2. классы разбавителей
3. разбавители желточные, молочные, температурный режим
4. ферментативные разбавители. Применение антибиотиков, гормонов, витаминов
5. состав разбавителей
После оценки сперму направляют для разбавления. Разбавление стало эффективным только тогда, когда были разработаны способы хранения спермы. Еще в 1900 г. И.И. Иванов установил, что спермии (С). способны жить и сохранять свою оплодотворяющую способность во внешней среде без секретов п.п.ж. это дало возможность применять для разбавленья спермы различные изотонические растворы. Хорошо подобраны и правильно приготовленных разбавителях С живут дольше, чем в естественной среде - плазме. Значит разбавитель является физиологически активной и защитной средой, но разбавители не являются питательными материалами для С ведь для спермиев свойственен односторонний обмен веществ - разрушительный каннибализм, поэтому они не усваивают питательные в-ва из сред. Особенность С заключается в том, что они имеют 1) гаплоидный набор хромосом - т.е. не полное ядро, а полуядро - гаплоидное ядро, полностью обладая наследственностью, присущей определенной породе ж-х, но не способно самостоятельно продолжать свое развитие т.к. превращаться в живой организм, без взаимного слияния с яйцеклеткой (оплодотворение).
2) диссимиляцию (разрушительный обмен веществ.
3) подвижность 5-10 мм в мин ( при t - 38-40 градусов).
Основная функция С - оплодотворить яйцеклетку. Для этого затрачивается определенное количество энергии, повышается обмен в-в, накапливаются продукты метаболизма и происходит аутоинтоксикация. Для того чтобы как можно дольше сохранить его жизнь и оплодотворяющую способность сперму разбавляют и хранят при определенном температурном режиме. Эти два процесса должны быть произведены наиболее правильно, чтобы неблагоприятные побочные эффекты были снижены или сведены на нет.
Значить разбавление необходимо не только для того, чтобы увеличить объем и тем самым удешевить стоимость, а так же рационально использовать высококлассных производителей для осеменения самок в значительно больших масштабах, а также для обеспечения выживаемости спермы и высокой ее оплодотворяющей способности.
Разумеется устранить все причины вызывающие гибель С одним каким-либо из способов невозможно, практически пользуются несколькими способами и в различных их комбинациях. Пример: разбавление сочетают с охлаждением или разбавление и замораживание.
Иванов использовал простые растворы - бикарбонат Na, р-р Фингера, кровь и установил сроки выживания С. Эти среды не являются биологически полноценными. В последнее время разрабатывают более подходящие разбавители для спермы. Одни исследователи предлагали естественные жидкости животных или растительных организмов (кровь, сыворотка, молоко, мед, томатный сок, сок плодов, какао и т.д.) другие создали искусственные синтетические среды, строго определяющие состав. В практике получили широкое распространение синтетические среды, в состав которых входят в-ва обладающие свойством буферности, предупреждающие t шок, при замораживании предупреждающие гибель С от кристаллов льда (глицерин), ускоряющие движение С в пол. путях самки и повышающие оплодотворяющую способность самок и антибиотики с сульфаниламидами действующие на микрофлору. Составляя разбавители следует особенно учитывать осмотическое давление и условия изотонии.
Сохранение жизнеспособности С вне организма основано на явлении анабиоза - обратимого неактивного состояния, при котором обменные процессы в клетках замедляются. Но при создании определенных оптимальных условий обменные процессы в клетках восстанавливаются.
Значить синтетические разбавители являются для С защитной средой вне организма самца предохраняющие их от преждевременного старения, разрушения и гибели.
Разбавители не должны иметь слишком кислую или щелочную реакцию, поэтому используются очень слабые кислоты или щелочи и в небольших количествах. Включать в разбавители многовалентные металлы (Ca, Mg, олово, свинец алюминий, железо и др.) строго запрещается, т.к. они несут «+» заряд, нейтрализуют «-» заряд С и происходит агглютинация.
В зависимости от свойств состава и действия синтетических сред на спермиев В.К. Милованов делит их на 3 класса:
1) Класс А - экстендоры (от латинского слова увеличивать), представляют собой, двухкомпонентные смеси изотонических растворов, это сахаров (глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, гликокол) и калиевые или натриевые соли (сульфаты, фосфаты, цитраты). Чаще всего используют глюкозу, лактозу и лимоннокислый натрий (цитрат).
Экстенедоры - применяются для разбавления спермы т.е. для увеличения объема ее при немедленном использовании на месте для осеменения самок. Для длительного хранения и транспортировки спермы экстендоры не пригодны.
2) Класс Б - протекторы или защитные среды. Они содержат в своем составе: 1) сахаро-солевые растворы (экстендоры) и вещества обладающие защитными свойствами т.е. защищающие С от неблагоприятных условий при хранении и перевозке спермы: желток куриного яйца, сульфаниламиды, антибиотики. Это разбавители которые позволяют хранить сперму в течении 2-3 дней при Т -0 градусов. Какими же свойствами обладают данные компоненты.
Желток куриного яйца - содержит около 7% свежего не окисленного лецитина (фосфолипид), вам известно, что лецитин относится к классу жиров, он обволакивает оболочку С тем самым способствует ее сохранению, повышает устойчивость к охлаждению от холодового удара. Часть лецитина, окисляясь в процессе дыхания С используется как питательный материал на выработку энергии, что предохраняет липиды протоплазмы С от расходования.
Глицерин - вводят в разбавитель для защиты С от кристаллизации при глубоком замораживании. Он обладает гигроскопичностью и проникает в клетку равномерно, замедляет до некоторой степени и предупреждает кристаллизацию льда, т.е. стеклование.
Антибиотики и белый стрептоцид задерживают развитие микроорганизмов попадающих в сперму при ее получении и разбавлении или при осеменении самок. Однако исследованиями было установлено, что чувствительность различных микробов и простейших к медикаментам различна. Пример трихомонады быстро погибают от препаратов йода и не чувствительны к антибиотикам, возбудитель вибриоза наиболее чувствителен к стрептомицину, менее к другим антибиотикам и не чувствителен к раствору йода. Кишечная и синегнойная полочки погибают от сульфаниламидов, но не чувствительны к пенициллину т.к. вырабатывают фермент пенициллиназу, разрушающий пенициллин. В настоящее время применяют для дезинфекции спермы белый стрептоцид, стрептомицин, пенициллин, сочетание которых обеспечивает более широкий спектр действия на самые различные микроорганизмы - это бактериологическая среда и наз. спермосан применяется для санации спермы во время разбавления.
3) Класс В - имплементоры - это среды, оснащенные физиологическими активными веществами (имплемент - оснащение, оборудование) оказывающими действие на половой аппарат и организм самки. Основу имплементаров составляют протекторные среды к которым добавляют фермент муциназу или гормональные и нейротропные препараты, усиливающие моторикку матки и ускоряющие продвижение спермы (окситоцин, питуитрин, карбохолин, прозерин). Прибавка к разбавителю препаратов усиливающих моторику матки повышает оплодотворяющую способность коров и свиней на 10-15%. Окситоцин или питуитрин в дозе 5 М.Е. на одно осеменение добавляют к каждой дозе разбавленной спермы хряка (на 100 мл) непосредственно перед осеменением. На С быка жидкий питуитрин оказывает токсическое действие поэтому в разбавитель его не добавляют им можно орошать слизистую влагалища коровы до или после осеменения, доза 2 мл.
Карбохолин добавляют в дозе 0,2-0,25 г. на 100 мл разбавителя для спермы быка. Следует учитывать, что искусственное усиление моторики матки у свиней, по сравнению с физиологической нормой иногда вместо пользы может принести вред т.к. возникающие при этом усиленные перистальтические сокращения матки выталкивают сперму наружу и оплодотворяемость самки снижается.
Качество разбавителя оценивают по степени разбавления, при которой достигается наивысшая живучесть спермы, в тех же условиях. Если среда не пригодна для разбавления спермы, то при любой степени разбавления живучесть спермы будет ниже по сравнению с неразбавленной спермой.
Пригодные для разбавления спермы среды имеют определенный оптимум и максимум разбавления. Оптимум разбавления - это такая степень разбавления, при которой достигается наивысшая живучесть С (обычно в несколько раз превышающая живучесть неразбавленной спермы). Максимум разбавления - наибольшая степень разбавления, при которой живучесть разбавленной спермы еще не падает ниже живучести неразбавленной спермы принимается за единицу.
Минимальные показатели свежее взятой спермы допускаемой к разбавлению искусственными средами
Вид производителя Концентрация спермы Активность
млн. С в 1 мл спермиев в баллах
Быки 0,5 8
Бараны 2,0 8
Хряки 0,15 7
Жеребцы 0,15 5
При приготовлении разбавителей нужно соблюдать все предъявленные к нему требования: 1) стерильность - помещение, халаты, инструменты. Сильно загрязненную посуду в которой находились желток, желточный разбавитель или сперма выдерживают в течении суток в хромовой смеси (хромпик) 1 кг двухромового кислого К, 10 л воды и постепенно по стенке сосуда добавляют 1 кг крепкой серной кислоты. Новую посуду после мытья выдерживают 24 часа в р-ре соляной к-ты (20 мл дымящейся соляной к-ты на 3 л а. d.). Дистиллированную воду нужно прокипятить и остудить до 30-40 градусов или применять бидистиллят. Водопроводную и колодезную воду употреблять нельзя т.к. в ней имеются растворенные вещества (состав и качество не известны).
2) Растворы должны быть только изотонические т.е. осмотическое давление примерно одинаковое осмотическому давлению С данного вида животного для которого предназначен разбавитель. А так же он должен соответствовать характерным особенностям данного производителя. Пример: сперма быка и барана густая имеет сл. кислую реакцию и при хранении в ней накапливается быстро молочная к-та, значит разбавитель должен содержать буферные соли (цитрат, фосфаты) нейтрализующие кислоту. Для спермы жеребца и хряка введение буферных солей излишне т.к. в плазме спермы их достаточно много содержится, а вот в разбавитель добавление сахаров (лактозы, фруктозы, сахарозы, глюкозы), лецитин вводимый с желтком куриного яйца, а также цитрат натрия трехзамещенный является для С энергетическим материалом и не только для разбавления спермы жеребца и хряка, но и для других производителей поэтому они входят в большинстве разбавителей. Хлористые соли в разбавитель вводить не следует, так как ион хлора действует разрушающе на липопротеиновый покров С.
Применяемые компоненты должны быть высокого качества и храниться в сухом месте в хорошо закрытых банках с притертыми пробками. Отсыревшие реактивы употреблять нельзя, т.к. неизвестно, сколько ими поглощено воды. Применяемые соли лимонной и фосфорной кислот должны быть кристаллизованными, а побелевшие , т.е. имеющие белую окраску применять нельзя, т.к. они частично потеряли кристаллизационную воду, которая придает им блеск.
Компоненты отвешивают и отмеряют с исключительной точностью, и должен соблюдаться определенный порядок их растворения.
В горячем растворе можно растворять сахара, лимонно-кислый натрий, стрепоцид (если нет растворимого берут обыкновенный стрептоцид и растворяют первым в горячей воде качество от этого не меняется), каждый компонент растворяется до полного растворения, а при t 30 С растворяют уже такие вещества, как желток куриного яйца (жкя), муциназа, антибиотики (пенициллин, стрептомицин), при более высокой t они инактивируются, а желток свертывается.
Но если на станциях и.о. отсутствуют необходимые реактивы, нет условий для их хранения, можно пользоваться сухими синтетическими средами в порошке. Их выпускает цех синтетических сред центральной станции и.о. (московская обл., подольский р-н, п/о Стрелкова) и высылают по заявкам. В состав сухих сред входят все необходимые компоненты, включая желток (не всегда) и фермент муциназа. Растворив такой порошок в теплой воде, полученную среду сразу же используют для разбавления спермы.
К естественным разбавителям относится молоко - биологически полноценная жидкость организма по физико-химическим свойствам (pH, вязкость, осмотическое давление) оно сходно с сывороткой спермы и секретами слизистой оболочки матки в период охоты. Переживаемость С в молочном разбавителе и оплодотворяемость коров и кобыл часто бывает высоким и даже выше, чем при применении обычных разбавителей. Для разбавления спермы жеребца берут свежевыдоенное цельное молоко кобылы, для спермы барана, быка, хряка - коровье молоко (для спермы хряков - обезжиренное). Т.к. сырое молоко оказывает токсическое действие на спермиев и содержит большое количество микробов, попавших при дойке, то его перед разбавлением С следует процедить через стерильную марлевую салфетку и покипятить 2-3 мин, чтобы не подгорело и не испарялось и охлаждают до 30-35 градусов, потом еще раз процеживают и добавляют к 100 мл молока 20 мл желтка. Если разбавленную сперму не собираются охлаждать до 0 градусов и хранить, то желток можно не добавлять. Молочный разбавитель расходуют в течение того же дня.
Недостатки молочного разбавителя: затруднение в определении активности С (поэтому при определении активности С к капле разбавленной молоком спермы добавляют 1-2 капли изотонического р-ра NaCl). Молоко берется от здоровых коров не жирномолочных, через 2 м-ца после отела.
Так же можно разбавлять сперму сухим молоком (в порошке). Т.В. Зверева рекомендует применять продажное молоко с этикеткой "Сухое молоко для детей". В состав такого разбавителя входят : сухое молоко полужирное - 10,0; стрептоцид белый растворимый - 0,375; пенициллин - 100000 ед, стрептомицин - 100000 ед, вода дистиллированная - 100 мл.
Готовят так: сухое молоко растворяют в дист.воде, фильтруют, добавляют белый стрептоцид и ставят в кипящую водяную баню на 10-15 мин до полного растворения. Затем р-р извлекают, охлаждают до 30 градусов и добавляют пенициллин со стрептомицином. Если готовят молочно-желточную среду, то на 100 мл молочного разбавителя добавляют 12 мл желтка.
Степень разбавления спермы зависит от вида производителя, качества спермы. Чем концентрация С выше, тем большую степень разбавления можно применять.
Сперму барана можно разбавлять в 2-4 раза (1:1, 1:3) в дозе (0,1 - 0,15 мл) - необходимо для осеменения одной овцы должно содержаться 75-100 млн активных сперматозоидов.
Более высокие степени разбавления отрицательно сказываются на проценте оплодотворяемости самок, что очевидно связано с понижением вязкости разбавленной спермы и вытеканием ее из шейки матки.
Разработка специальных сред, позволяющих увеличить степень разбавления спермы барана, будет иметь большое практическое значение.
Сперму быка разбавляют - в 10-40 раз (1:9; 1: 39), а в некоторых случаях применяют и больше степени разбавления. В 1 мл разбавленной спермы должно содержаться 25-50 млн С с прямым поступательным движением. Но иногда хорошего качества сперма быка разбавляется в 60-100 раз, живучесть С не нарушается и осеменяют коров такой спермой для более высокого показателя в 4-6 раза.
Сперму жеребца разбавляют в 2-4 раза (1:1:1:3).
Сперму хряка в 2-6 раз доза 25-30 мл (1:1 и 1:5) 300-400 млн С в дозе.
В дозе для осеменения свиньи должно содержаться 4-5 млр, а при фракционном методе 2-3 млр. С.
После разбавления сперму обязательно сразу исследуют на активность С, через час повторяют, если активность снизилась сперму бракуют и разбавитель готовят заново. Иногда снижение активности бывает временным и через 1-1,5 мин восстанавливается полностью.
Сперму нужно разбавлять постепенно 1:1; 1:2; 1:3, а через 10 мин провести окончательное разбавление, т.е. что бы сперма адаптировалась., а если сразу разбавить сперму, т.е. одноразовое пример 1:50 - глюкозо - цитратным желточным разбавитель, абсолютный показатель выживаемости С снижается на 16% по сравнению с постепенным разбавлением, количество мертвых увеличивается на 9,3% в сравнении с постепенным разбавлением. Поэтому при больших степенях разбавления сперму следует разбавлять постепенно 1:2; 1:1 прямо в спермоприемнике, а через 10 мин провести окончательное разбавление спермы до намеченной цели.
В чем заключается правила разбавления спермы?
1. во-первых сперму нужно разбавлять как можно быстрее при ее получении (5-10 мин)
2. разбавление производят в специальном смесители или минзурке с делением, куда сперму уже разбавленную переливают из спермоприемника.
Пр: быка + 10 мл среды, а барана сперму разбавляют в спермоприемнике сперму полученную от быка при дуплетной садке не смешивают, а разбавляют каждую отдельно и только после проверки ее на активность и если она доброкачественная ее смешивают.
3. в момент смешивания Т должна быть одинаковой с Т среды 34-35 С, если среда остыла ее нужно подогреть на водяной бане.
4. Разбавление лучше производить в специальных настольных боксах, где поддерживается Т 28-35 С.
5. При разбавлении учитывают густоту, абсолютный показатель живучести, концентрацию. Качество разбавителя учитывают не только по тому сколько времени сохраняют подвижность С в разбавленной сперме, а главное сколько они могут жить при разных степенях разбавления.
Готовят среду следующим образом. В стерильную стеклянную химическую колбу наливают необходимый объем прокипяченной дист.воды. воду отмеряют мерным цилиндром, затем по порядку вводят соответствующие компоненты отмеренных на аналитических весах до полного растворения каждого (глюкозу, лимонно-кислый натрий, стрептоцид). Фильтруют через стерильный фильтр и остужают до Т 40-45 С, затем добавляют санирующий препарат спермосан - 3 на 1000 мл - 10 тыс . ед. и колбу со средой закрывают пергаментной бумагой.
6. Если сперму будут хранить при низких Т около 0 С, то к среде добавляют 30-40 мл на 1000 мл среды жкя - среду тщательно встряхивают до однородной массы (суспензии).
7. Правильность приготовления среды проверяют при разбавлении каждого эякулята: на теплое стекло капают сперму и разбавитель, если активность не снизилась, то разбавляют весь эякулят, постепенно приливая разбавитель к сперме, все время помешивая).
Почему приливают разбавитель к сперме, а не наоборот, потому что если приливать сперму в разбавитель, то С попадают в среду очень большого разбавления и могут погибнуть. Если станции и.о. приступают к использованию нового рецепта, который еще не применялся для разбавления спермы, или используют какой-то новый реактив для приготовления среды, или в случае понижения оплодотворяемости, проводится биоконтроль. Особенно важно проводить биоконтроль при получении новой серии антибиотиков, т.к. некоторые из них имеют повышенную токсичность и отрицательно влияют на живучесть С. Обычно биоконтроль проводится 1 раз в 3 месяца.
Приготовленная среда используется в течение 3-4 часов с момента ее приготовления и хранят ее в водяных банях при Т 34-35 С в стеклянных колбах или полиэтиленовых флаконах. Еще раз повторяю разбавляют сперму барана, быка с активностью не ниже 8 баллов, хряка - 7 баллов и жеребца - 6 баллов.
Какие же компоненты входят в состав разбавителей?
Состав разбавителей бывает различным в зависимости от вида ж-го и способа хранения разбавленной спермы.
Более широко распространены 2 группы:
1. кратковременный способ хранения, при т 0 С и комнатной Т
+ 6 +10 С жкя
+16 +20 С без жкя
быка, барана, хряка, жеребца.