Рис. 5.5. Принцип выявления антител в твердофазном ИФА
Для выявления антител известный антиген адсорбируют в лунках полистироловой пластины. Затем вносят исследуемую сыворотку, в которой хотят обнаружить антитела к данному антигену. После инкубации лунки промывают для удаления несвязавшихся белков и вносят в них антииммуноглобулиновые антитела, меченные ферментом (обычно пероксидазой). После инкубации и отмывания в лунки добавляют специфичный для фермента субстрат (перекись водорода) и хромоген (орто-фенилендиамин) для регистрации конечных продуктов расщепления субстрата. О наличии и количестве антител судят по изменению цвета и интенсивности окраски раствора. Для регистрация окраски используют специальные спектрофотометры с вертикальным ходом луча (ридеры-мультисканы).
Методы ИФА обладают высокой чувствительностью и специфичностью и получили широкое распространение в различных областях биологии и медицины.
Иммуноблотинг (вестерн-блотинг).
Часто бывает, что АГ представляет собой сложную смесь разнородных молекул. С другой стороны, к такому комплексному АГ вырабатывается набор различных АТ. Для одновременного обнаружения различных фракций АГ либо АТ в исследуемом материале применяют метод вестерн-блотинга. В частности, он используется при диагностике ВИЧ-инфекции для обнаружения АТ к различным вирусным АГ. Для этого известный набор вирусных белковых АГ подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле. АГ мигрируют в геле в зависимости от их молекулярной массы и заряда. После окончания электрофореза на пластину с гелем накладывают лист нитроцеллюлозной мембраны (НЦМ) и проводят повторный электрофорез в поперечном направлении. АГ выходят из геля и прикрепляются к листу нитроцеллюлозной мембраны.
Далее лист НЦМ с отпечатками АГ (блот – отпечаток) обрабатывают сывороткой больного, содержащей АТ. Если АТ есть, то они связываются с НЦМ по месту локализации различных фракций АГ.
Далее метод не отличается от гетерогенного иммуноферментного анализа: НЦМ промывают для удаления несвязавшихся белков и вносят в них антииммуноглобулиновые антитела, меченные ферментом (пероксидазой). После инкубации и отмывания НЦМ помещают в раствор субстрата (перекись водорода) и хромогена (диаминобензидин и др.) О количестве фракций антител к различным АГ фрагментам судят по появлению нескольких окрашенных пятен на НЦМ.
Радиоиммунологический анализ.
Принцип радиоиммунологического анализа (РИА) основан на выявлении комплекса АГ-АТ, в котором один из иммунореагентов был мечен радиоактивным изотопом. Обычно используют изотопы йода (125I или 131I). Учет реакции проводят по убыванию или по возрастанию радиоактивности (в зависимости от методики РИА) с помощью специальных счетчиков b- или g-излучения. Метод высокочувствителен, но постепенно вытесняется иммуноферментным анализом, учитывая небезопасность работы с радиоактивными изотопами и необходимость в сложном регистрирующем оборудовании.
Однако там, где в качестве АГ выступает низкомолекулярный гаптен (например, лекарственные препараты, стероидные и пептидные гормоны и др.) РИА используется весьма широко. Существуют его гетерогенные варианты, аналогичные ИФА, а также конкурентные варианты.
В последнем случае на твердую фазу (например, полистироловые шарики) сорбируют известные АТ в комплексе с радиоактивно меченым АГ (например, лекарственным препаратом) в известной концентрации. К этому комплексу добавляют исследуемый материал, содержащий неизвестную концентрацию изучаемого лекарственного препарата-АГ. Он вытесняет из комплекса меченый АГ пропорционально своей концентрации. Радиоактивность вытесненного АГ измеряют с помощью счетчика и определяют концентрацию неизвестного АГ.
К леточные методы оценки иммунитета