5 Моноклональные антитела
Моноклональные антитела являются продуктами одного из множества клонов антителообразующих клеток (АОК) и обладают строгой специфичностью по отношению к определенной антигенной детерминанте (эпитопу) того или иного антигена. Технология получения моноклональных антител разработана Георгом Келлером и Цезарем Мельштаймом, которые в 1984 г. получили Нобелевскую премию за их открытие. Сущность метода заключается в получении неограниченно долгоживущего клона клеток, продуцирующего антитела узкой специфичности. Для этого лабораторные животные (млекопитающие, например, мыши) подвергаются иммунизации, обычно, путем нескольких инъекций антигена в течение 1-2 месяцев. Затем из селезенки получают клетки, из которых выделяют лимфоциты. Их сливают с клетками миеломы, которую выбирают так, чтобы она сама по себе не производила антитела и не имела гена гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (HHPТ), что делает ее чувствительной к селектирующему агенту НАТ (гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Слияние клеток производится с помощью нарушающего мембраны агента, такого, как полиэтиленгликоль или вирус Сёндай.
После слияния клетки в течение 10-14 дней поддерживают в среде, содержащей НАТ (гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Аминоптерин блокирует синтез нуклеотидов, поэтому клетки материнской миеломы погибают. В отличие от миеломы, гибридные клетки и В-лимфоциты, имеющие ген ГГФТ, выживают за счет использования гипоксантина как источника пуринов, но продолжительность жизни обычных лимфоцитов ограничена, и через несколько недель в культуре остаются только клетки гибридомы. Поскольку не все из них образованы путем слияния миеломы с лимфоцитами, производящими нужные антитела, клетки делят на линии, которые поддерживают в отдельных ячейках 96-луночных планшетов. Далее в среде над клетками определяют антитела и отбраковывают клеточные линии, не производящие антитела или недостаточно быстро размножающиеся. При достаточно хорошем разведении клеточной суспензии в одну лунку попадает не более одной гибридной клетки, но для гарантированного качества и стабильности культуры отобранные клеточные линии могут быть еще раз клонированы с тем, чтобы антитела производились потомками одной гибридной клетки, то есть были моноклональными.
Клонированную культуру гибридомы затем пересевают из лунки 96-луночной плашки в сосуды большей емкости для размножения, хранения в жидком азоте и получения большего количества антител для дальнейших исследований. Из культуральной среды можно получить от 1 до 60 µg/ml моноклональных антител. Большее количество можно получить путем введения клеточной суспензии в брюшную полость мышей, где гибридома размножается подобно раковым клеткам материнской миеломы, секретируя антитела во внутриполостную жидкость с образованием асцита (скопление жидкости в брюшной полости).
Моноклональные антитела могут использоваться для разных практических целей:
• для идентификации клеток – выявления Т- и В-лимфоцитов и других клеток, определения их свойств;
• для осуществления современных радиоиммунных, иммуноферментных и иммунолюминесцентных методов выявления антигенов и антител;
• для определения локализации антигенов в организме и доставки к ним (например, в опухоль) лекарственных веществ, присоединенных к антителам;
• для приготовления иммуносорбентов, позволяющих выделить ели удалить из организма антигены или клетки данной специфичности.
6 Характеристика основных классов иммуноглобулинов
IgM . Молекула этого иммуноглобулина представляет собой полимерный Ig из пяти субъединиц, соединенных дисульфидными связями и дополнительной J-цепью, имеет 10 антиген - связывающих центров. Филогенетически это наиболее древний иммуноглобулин. IgM – наиболее ранний класс антител, образующихся при первичном попадании антигена в организм. Наличие IgM-антител к соответствующему возбудителю свидетельствует о свежем инфицировании (текущем инфекционном процессе). Антитела к антигенам грамотрицательных бактерий, жгутиковым антигенам – преимущественно IgM-антитела. IgM – основной класс иммуноглобулинов, синтезируемых у новорожденных и младенцев. IgM у новорожденных – это показатель внутриутробного заражения (краснухой, ЦМВ, токсоплазмозом и другими внутриутробными инфекциями), поскольку материнские IgM через плаценту не проходят. Концентрация IgM в крови ниже, чем IgG – 0,5-2,0 г/л, период полураспада – около недели. IgM способны агглютинировать бактерии, нейтрализовать вирусы, активировать комплемент, активизировать фагоцитоз, связывать эндотоксины грамотрицательных бактерий. IgM обладают большей, чем IgG авидностью (10 активных центров), аффинность (сродство к антигену) меньше, чем у IgG.
Ig G . Мономеры, включают четыре субкласса. Концентрация в крови – от 8 до 17 г/л, период полураспада – около 3-4 недель. Это основной класс иммуноглобулинов, защищающих организм от бактерий, токсинов и вирусов. В наибольшем количестве IgG-антитела вырабатываются на стадии выздоровления после инфекционного заболевания (поздние или 7S антитела), при вторичном иммунном ответе. IgG1 и IgG4 специфически (через Fab- фрагменты) связывают возбудителей (опсонизация), благодаря Fc-фрагментам IgG взаимодействуют с Fc-рецепторами фагоцитов, способствуя фагоцитозу и лизису микроорганизмов. IgG способны нейтрализовать бактериальные экзотоксины, связывать комплемент. Только IgG способны транспортироваться через плаценту от матери к плоду (проходить через плацентарный барьер) и обеспечивать защиту материнскими антителами плода и новорожденного. В отличие от IgM-антител, IgG-антитела относятся к категории поздних – появляются позже и более длительно выявляются в крови.
IgA . Выделяют сывороточные IgA (мономер) и секреторные IgA (IgAs). Сывороточные IgA составляют 1,4-4,2 г/л. Секреторные IgAs находятся в слюне, пищеварительных соках, секрете слизистой носа, в молозиве. Они являются первой линией защиты слизистых, обеспечивая их местный иммунитет. IgAs состоят из Ig мономера, J-цепи и гликопротеина (секреторного компонента). Выделяют два изотипа – IgA1 преобладает в сыворотке, субкласс IgA2 – в экстраваскулярных секретах.
Секреторный компонент вырабатывается эпителиальными клетками слизистых оболочек и присоединяется к молекуле IgA в момент прохождения последней через эпителиальные клетки. Секреторный компонент повышает устойчивость молекул IgAs к действию протеолитических ферментов. Основная роль IgA – обеспечение местного иммунитета слизистых. Они препятствуют прикреплению бактерий к слизистым, обеспечивают транспорт полимерных иммунных комплексов с IgA, нейтрализуют энтеротоксин, активируют фагоцитоз и систему комплемента.
IgE. Представляет мономер, в сыворотке крови находится в низких концентрациях. Основная роль – своими Fc-фрагментами прикрепляется к тучным клеткам (мастоцитам) и базофилам и опосредует реакции гиперчувствительности немедленного типа. К IgE относятся «антитела аллергии» – реагины. Уровень IgE повышается при аллергических состояниях, гельминтозах. Антигенсвязывающие Fab - фрагменты молекулы IgE специфически взаимодействует с антигеном (аллергеном), сформировавшийся иммунный комплекс взаимодействует с рецепторами Fc- фрагментов IgE, встроенных в клеточную мембрану базофила или тучной клетки. Это является сигналом для выделения гистамина, других биологически активных веществ и развертывания острой аллергической реакции.
IgD . Мономеры IgD обнаруживают на поверхности развивающихся В-лимфоцитов, в сыворотке находятся в крайне низких концентрациях. Их биологическая роль точно не установлена. Полагают, что IgD участвуют в дифференциации В-клеток, способствуют развитию антиидиотипического ответа, участвуют в аутоиммунных процессах.
С целью определения концентраций иммуноглобулинов отдельных классов применяют несколько методов, чаще используют метод радиальной иммунодиффузии в геле (по Манчини) – разновидность реакции преципитации и ИФА.
Определение антител различных классов имеет важное значение для диагностики инфекционных заболеваний. Обнаружение антител к антигенам микроорганизмов в сыворотках крови – важный критерий при постановке диагноза – серологический метод диагностики. Антитела класса IgM появляются в остром периоде заболевания и относительно быстро исчезают, антитела класса IgG выявляются в более поздние сроки и более длительно (иногда годами) сохраняются в сыворотках крови переболевших, их в этом случае называют анамнестическими антителами.
Выделяют понятия: титр антител, диагностический титр, исследования парных сывороток. Наибольшее значение имеет выявление IgM-антител и четырехкратное повышение титров антител (или сероконверсия – антитела выявляют во второй пробе при отрицательных результатах с первой сывороткой крови) при исследовании парных проб, взятых в динамике инфекционного процесса с интервалом в несколько недель.
Реакции взаимодействия антител с возбудителями и их антигенами (реакция «антиген-антитело») проявляется в виде ряда феноменов - агглютинации, преципитации, нейтрализации, лизиса, связывания комплемента, опсонизации, цитотоксичности и могут быть выявлены различными серологическими реакциями.