Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах
Более совершенным методом является культивирование вирусов в куриных эмбрионах. Впервые оно применено Раусом в 1911 году на примере вируса саркомы белых мышей. Это наиболее доступный и удобный метод, как для первичного выделения вирусов, так и для последующего культивирования их в лаборатории. Достоинства: возможность накопления вирусов в больших количествах, стерильность объекта, отсутствие скрытых вирусных инфекций, простота техники работы. Для культивирования вирусов используют живые куриные эмбрионы 5–15-дневного возраста. На размножение вирусов в них оказывает влияние температура инкубации яиц, метод заражения, возраст и количество введенного вируса. Цели использования куриных эмбрионов: 1. Обнаружение и первичное выделение вируса из патматериала. 2. Накопление вирусной биомассы (биопроба). 3. Поддержание вируса в активном состоянии (пассаж). 4. Титрование вирусов. 5. Получение эмбрион-вакцин. 6. Тест-объект в реакции нейтрализации. Способов заражения куриных эмбрионов: на хорион-аллантоисную оболочку (ХАО), аллантоисную полость, в амниотическую полость, желточный мешок, тело зародыша, кровеносные сосуды. Для культивирования можно использовать деэмбринированные яйца, когда удаляют эмбрион из яйца в период, когда к его скорлупе изнутри полностью прилегает ХАО. Если внутрь такого яйца добавить питательную среду, образуется своеобразная культура ткани, в которой может репродуцироваться вирус. Недостатки культивирования вирусов в куриных эмбрионах: 1.Куриные эмбрионы могут быть носителями других микроорганизмов (сальмонеллы, туберкулезная палочка), в том числе вирусов (лейкоза птиц, бронхит кур и др.) и противовирусных антител. 2.Не все вирусы культивируются в куриных эмбрионах.
Культивирование вирусов на культурах тканей и клеток. Культура клеток – это клетки многоклеточного организма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма. Методика культивирования клеток особенно успешно стала развиваться после 40-х годов. Этому способствовали следующие обстоятельства: открытие антибиотиков, которые предотвращают бактериальное заражение культур клеток, открытие Эндерсом (1949) способности вирусов вызывать деструкцию клеток (цитопатический эффект), наконец, Дульбекко предложил методику трипсинизации тканей и получения однослойных культур клеток.Цели использования культур клеток: 1. Обнаружение и первичное выделение вируса из патматериала.2. Накопление вирусной биомассы (биопроба).3. Поддержание вируса в активном состоянии (пассаж). 4. Титрование вирусов. 5. Получение культуральных вакцин. 6. Тест-объект в реакции нейтрализации.
В зависимости от техники приготовления и культивирования различают следующие типы культур клеток и тканей: 1) Культуры переживающих тканей:– растущие под слоем агара;– растущие в жидкой среде. 2)Культуры растущих тканей: – органные культуры; – однослойные культуры клеток; – культуры суспензированных клеток.
Наибольшее практическое применение получили однослойные культуры, растущие на поверхности стекла лабораторной посуды в виде монослоя клеток. Однослойные культуры клеток по числу жизнеспособных генераций в свою очередь подразделяют на: первичные, или первично-трипсинизированные, перевиваемые и полуперевиваемые.
Однослойные культуры клеток: 1)Первично-трипсинизированные клетки – клетки, полученные из органов или тканей организма, растущие в один слой. Клетки имеют диплоидный набор хромосом. Культуру клеток можно получить практически из любого органа или ткани человека, или животных (взрослого или эмбриона). Однако лучше удается получить из эмбриональных органов, так как клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2–3 часов после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают их и обрабатывают ферментом (чаще трипсином). Трипсин разрушает межклеточное вещество, (затем трипсин удаляют при помощи цен-трифугирования) полученные отдельные клетки выращивают в питательной среде на внутренней поверхности стекла (пробирки, флакона, матраса) при 37 оС. Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делиться. Обычно монослой формируется через 3–5 дней. При пассаже культуры получают субкультуры (от 2–5 пассажей). Недостаток первичных однослойных культур клеток: для приготовления новых культур необходимо всегда иметь органы от здоровых животных, могут содержать инфекционные контаминаты. 2)Перевиваемые культуры клеток – это клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. Получают перевиваемые клетки из здоровых тканей, так и из опухолевых (первичных культур). Клетки имеют гетероплоидный набор хромосом. В настоящее время получено многочисленное количество перевиваемых линий клеток животного и человеческого происхождения: Hela (из раковой опухоли шейки матки негритянки по имени Елена), Hep (из карциномы гортани человека), KB (из раковой опухоли полости рта), ППТ (перевиваемая почка теленка), ППО (перевиваемая почка овцы), L (мышиные фибробласты) и другие.
Достоинства перевиваемых клеток :–приготовление значительно проще, т.е. лаборатория не зависит от ис-точников тканей, так как клетки пересеваются бесконечно; – выдерживают большие концентрации антибиотиков; – поддерживаются в стандартном состоянии; – эти культуры заранее можно проверить на наличие латентных вирусов и микрофлоры; – большинство перевиваемых клеток обладает более широким спектром чувствительности к вирусам. Недостатки перевиваемых клеток: – обладают свойством безграничного роста, как опухолевые клетки; – быстро наступают деструктивные изменения; – может происходить снижение или утрата чувствительности к вирусам. . Однако злокачественный характер клеток и соматические мутации, претерпеваемые нормальными клетками в процессе многочисленных генераций, ограничивают использование этого вида культур, в частности невозможно их применение в производстве вирусных вакцин. 3)Диплоидные культуры клеток – это морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая ограниченный срок жизни, сохраняющая в процессе пассирования кариотип, свойственный исходной ткани, свободная от контаминантов. Диплоидные культуры клеток, так же, как и перевиваемые, получают из первичных культур клеток из различных тканей эмбриона человека (легкие, почки, кожно-мышечная ткань, сердце и др.) и животных (почка эмбриона КРС, свиней, почка хомяка и др.). В отличие от перевиваемых, имеют ограниченные возможности пассирования. Максимальное число пассажей 50±10, затем количество делящихся клеток резко уменьшается, и они гибнут. Однако, такие культуры живут длительно без смены питательной среды и имеют диплоидный набор хромосом. 3)Культуры суспензированных клеток растут и размножаются во взвешенном состоянии (на синтетических носителях) при постоянном интенсивном перемешивании среды. Они могут быть использованы для накопления большого количества вирусов, что используется для массового производства биопрепаратов. Некоторые вирусы лучше размножаются в органных культурах, которые представляют собой кусочки органов животного или человека, выращиваемых вне организма и сохранивших свойственную данному органу структуру.