Тема V. Дихання рослин
Робота 10. Виявлення дегідрогеназ в різних тканинах рослин.
Мета роботи. Оволодіти методом визначення дегідрогеназної активності в різних тканинах рослин.
Матеріали, реактиви, обладнання. Проросле насіння гороху, 50 мг/л розчину метиленового синього, водяна баня з термометром або термостат, фарфорова чашка, пробірки з гумовими пробками, склограф.
Основні відомості. Дегідрогенази - це ферменти, що каталізують перенесення водню від субстрату, який окислюється, до акцептора, що має більш високий окислювально-відновний потенціал.
Є дві групи дегідрогеназ:
Анаеробні дегідрогенази - це двокомпонентні ферменти, коферментом яких може бути нікотинамідаденіндинуклеотид (НАД+). У процесі окислення субстрату НАД+ перетворюється на відновлену форму НАДН2. До анаеробних НАД-залежних дегідрогеназ належать такі ферменти, як алкоголь-дегідрогеназа, лактатдегідрогеназа, металдегідрогеназа та ін. Анаеробні дегідрогенази передають водень, тобто електрон і протон, різним проміжним сполукам та аеробним дегідрогеназам.
Аеробні дегідрогенази це також двокомпонентні ферменти, які називають флавіновими. Крім білка до їх складу входять тісно зв’язані з ними простетичні групи - рибофлавін (вітамін В2). Розрізняють два коферменти цієї групи: флавіномононуклеотид (ФМН) і флавінаденіндинуклеотид (ФАД). Прикладом дегідрогенази, до складу якої входить ФАД, є сукцинатдегідрогеназа.
Щоб визначити активність дегідрогеназ, як акцептор водню можна ви-користати метиленовий синій, який у процесі відновлення переходить у безбарвну лейкоформу:
С-Н2 + М ® С + М-Н2,
де С-Н2 - субстрат; М - метиленовий синій; С - окислений субстрат; М-Н2 - відновлена фарба.
При наявності молекулярного кисню лейкоформа метиленового синього окислюється самостійно і знову набуває свого кольору.
1/2 О2 + 2Н+ + М ® М + Н2О.
Хід роботи. Оголити від шкірки 10-12 насінин, що наклюнулися, та розділити на сім’ядолі. Половину матеріалу помістити в колбу з водою і кип’ятити протягом 3 хв. При цьому руйнуються ферментні системи, Потім матеріал, що кип’ятили, та свіжий переносять в дві пробірки і заливають розчином метиленового синього. Через 5-10 хв., коли сім’ядолі інтенсивно забарвляться, зливають розчин фарби, промивають матеріал водою, після чого матеріал заливають дистильованою водою і закривають пробками. Пробірки ставлять у термостат або на водяну баню при t = 25-30° C. Відмічають знебарвлення сім’ядолею в одній з пробірок, після чого сім’ядолі висипають у чашку Петрі або фарфорову (без води), залишають на повітрі і спостерігають відновлення забарвлення. Описують результати і роблять відповідні висновки.
Контрольні запитання.
1. Що таке дегідрогенази?
2. Що спільного і чим відрізняються анаеробні та аеробні дегідрогенази?
3. В чому полягають принципи визначення активності дегідрогеназ?