Робота 7. Методика визначення каталази по Починок.
Мета роботи. Визначити кількість каталази в різних рослинних об’єктах.
Матеріали, реактиви, обладнання. Торзійні терези, ножиці, фарфорові ступки з пестами, колби, мірні піпетки місткістю 5 мл, 20 мл; бюретки, термометр; 17%-й розчин Н2О2, 10%-й розчин Н2SO4, 25%-й розчин КІ, 10%-й розчин (NH4)2MoO4, 0,01н. розчин Na2S2O3, 1%-й розчин крохмалю.
Основні відомості. Каталаза - двокомпонентний фермент, роль якого в організмі полягає у руйнуванні отруйного для клітин пероксиду водню за таким рівнянням:
2Н2О2 каталаза® 2Н2О + О2.
На світловій фазі фотосинтезу, а точніше фотохімічному її етапі під дією енергії сонячного світла відбувається реакція фотолізу води, проміжною сполукою якого є пероксид водню. Саме каталаза клітин зеленого листка і знешкоджує отруйну дію пероксиду водню шляхом розщеплення одноразово двох молекул його на воду і молекулярний кисень, яким збагачується повітря. Отже, у фотосинтезуючих тканинах листків каталаза завжди присутня, тому листок і є вдалим об’єктом для визначення її активності.
Хід роботи. Наважку 200мг рослинного матеріалу розтирають у ступці, додають 20 мл Н2О і все переносять у колбу, збовтують (для рівномірного розподілення).
5 мл цієї витяжки відбирають у колбу і додають 15 мл Н2О при Т = 15°- 17°С. Потім у ту ж колбу додають: 5 мл 17%-го розчину Н2О2, через 5 хвилин додають 5 мл 10%-го розчину Н2SО4 для нейтралізації Н2О2. Н2О2, що не розклалась, відтитровуємо йодометрично, для чого додають 1 мл 25%-го розчину КІ та 3-4 краплі 10%-го розчину (NH4)2MoO4 і титрують Na2S2O3 (0,01н) до жовтого кольору, потім треба додати 1 мл 1%-го розчину крохмалю і титрувати до знебарвлення.
Одночасно ставлять контроль, для чого беруть 20 мл Н2О, додають 5 мл Н2О2 і через 5 хвилин доливають 5 мл Н2SО4, потім також додають КІ і (NH4)2MoO4.
Формула розрахунку:
Іф = ( а - х ) × в × А
а × р × с
Іф - активність ферменту в мл;
а - кількість 0,01 н Na2S2O3, мл, затрачених на контроль;
х - кількість 0,01 н Na2S2O3, мл, затрачених на дослід;
в - реаційний об’єм ( 20 мл );
А - об’єм витяжки ( 20 мл );
р - наважка;
с - кількість мл суспензії, взятої на титрування ( 5 мл );
різниця ( а - х ) повинна бути в межах 3-5, в протилежному випадку необхідно брати більшу або меншу наважку.
Контрольні запитання.
Яка фізіологічна роль каталази?
Як продемонструвати дію каталази на розщеплення пероксиду водню в клітинах?